Peter Sarnow-ek editatua, Stanford Unibertsitateko Medikuntza Eskola, Stanford Unibertsitatea, Kalifornia, 2020ko abenduaren 25ean onartua (2020ko urriaren 25ean berrikusia)
Koronavirus-transkripzio-konplexuen errepliketan azpiunitateen arteko elkarrekintzaren berri ematen dugu, erreplikaziorako eta kontserbazio ebolutiborako ezinbestekoak direnak.Nsp12-ri lotutako NiRAN domeinuak trans-n nukleosido monofosfatoaren (NMP) transferasa-jarduera duela frogatu genuen, eta helburu gisa nsp9 (RNA lotzeko proteina bat) identifikatu genuen.NiRANek NMP zatiaren atxikimendu kobalentea katalizatzen du kontserbatutako nsp9 amino muturrarekiko Mn2+ ioietan eta ondoan dauden Asn hondakin kontserbatuetan oinarritzen den erreakzio batean.NiRAN jarduera eta nsp9 NMPylation ezinbestekoak direla koronavirusaren erreplikaziorako.Datuek habiatutako birusaren entzimaren markatzailearen jarduera hori aurreko behaketekin lotzeko aukera ematen digu RNA birusen klase batean RNA sintesiaren hasiera funtzionalki eta ebolutiboki koherentea dela dioen hipotesiaren arabera.
Nidoviralesen (Coronaviridae, Arterioviridae eta beste 12 familia) ARN-menpeko RNA polimerasa (RdRps) amino-terminal (N-terminal) domeinuarekin lotuta dago poliproteinatik askatzen den proteina ez-egituralean (nsp), NiRAN izenekoan. 1ab proteasa nagusi birikoz (Mpro) osatuta dago.Aurretik, NiRAN-RdRp nsp-ren birus arterialaren GMPylation/UMPylation jardueraren berri eman zen, eta nukleosido monofosfatoa (NMP) transferentziarako iragankorra sortzea iradoki zen (gaur egun ezezaguna) birusera eta/edo zelulen biopolimerizazio Gauzak.Hemen erakusten dugu koronavirusak (Giza koronavirus [HCoV]-229E eta arnas sindrome akutu larria koronavirus 2) nsp12 (NiRAN-RdRp) Mn2+-ren menpeko NMPilazio-jarduera duela, hau da, nsp9-tik eratorritako Mpro-ren bidez nsp9-ren eraketaren bidez. N-terminalaren alboko nsps proteolitikoki askatzen da, fosforamidatoa amina primarioarekin (N3825) lotzen da nsp9-ren N-terminalean.Uridina trifosfatoa da erreakzio honetan hobetsitako nukleotidoa, baina adenosina trifosfatoa, guanosina trifosfatoa eta zitidina trifosfatoa ere kosubstratu egokiak dira.Koronavirus birkonbinatuen nsp9 eta nsp12 proteinak eta ingeniaritza genetikoko HCoV-229E mutanteek erabilitako mutazio-azterketek NiRAN-en bidez nsp9 NMPilaziorako eta birusaren erreplikaziorako beharrezkoak diren hondakinak zehaztu zituzten zelula-kulturan.Datuek NiRAN gune aktiboko hondakinen iragarpena berretsi zuten eta nsp9 N3826 hondakinek nsp9 NMPilazioan eta birusaren erreplikazioan in vitro-ren eginkizun garrantzitsua zehaztu zuten.Hondakin hori N-terminaleko NNE tripeptido sekuentzia kontserbatuaren parte da eta koronavirusen familiako nsp9 eta bere homologoen hondar aldaezin bakarra dela frogatu da.Azterketa honek oinarri sendoak ematen ditu beste birus habiaratu batzuen NMPilazio-jardueraren azterketa funtzionala egiteko eta birusen aurkako sendagaiak garatzeko helburu posibleak proposatzen ditu.
Nidovirales kate positiboko RNA birusak hainbat ornodun eta ornogabe infektatzen ditu (1, 2).Aginduak 14 familia (3) biltzen ditu gaur egun, eta horietatik koronabirusaren familia sakon aztertu da azken 20 urteetan.Garai hartan, animalien ostalarietatik hiru koronavirus zoonotiko sortu ziren eta gizakietan arnas infekzio larrien agerraldi handiak eragin zituzten.Gaixotasun infekzioso akutu larriek eragindako pandemia iraunkorrak barne.Arnas sindromea Coronavirus 2 (SARS-CoV-2) (4âââ7).Nidobirusek genomaren antolakuntza komun bat partekatzen dute, eta mintzari loturiko erreplikazio-transkripzio konplexuaren (RTC) azpiunitatea 5-?²-terminaleko bi herenetan eta birusaren partikulen egiturazko azpiunitate nagusian kodetzen da, baita osagarri batzuetan ere. .Proteina, genomaren 3??² amaierako herenean kodetua (1).Planari birusen familia bat izan ezik (Monoviridae) (8), habiatutako birus guztiek RTC azpiunitateak kodetzen dituzte ORF1a eta ORF1b bi irakurketa marko ireki handitan (ORF), zeinak ARN genomikotik itzultzen diren.ORF1a poliproteina (pp) 1a kodetzen du, eta ORF1a eta ORF1b elkarrekin pp1ab kodetzen dute.ORF1a-k kodetutako proteasa nagusiaren (Mpro) partaidetza orokorrarekin, bai pp1a eta bai pp1ab proteina ez-egitural ezberdinetan (nsps) prozesatzen dira proteolitikoki, 3CLpro izenez ere ezagutzen direnak, pikornabirusaren 3Cpro-rekin homologia duelako ( 9).Nsp hauek RTC dinamiko handi batean muntatzen direla uste da, RNA genomikoaren (erreplikazioa) eta RNA azpigenomikoaren multzo baten (transkripzioa) sintesia katalizatzen dutela eta ORF1b-tik behera kokatutako ORFaren adierazpena koordinatzeko erabiltzen dira (10?? ?12).
RTC oinarrizkoak RNA-menpeko RNA polimerasa (RdRp) (13), superfamilia 1 helikasa (HEL1) (14, 15) eta RNA prozesatzeko hainbat entzima ditu, nagusiki ORF1b-n eta koronavirusen familian kodetuta daudenak. Nsp12-nsp16 eta nsp9-nsp12 Arterioviridae familian (ikus 10âââ 12. erreferentzia).RdRp eta HEL1 hegaztiaren habiaren birusaren bi (bosten bat) kontserbatutako domeinuak dira eta ARN birusen artean homologia dute.Core erreplikak beste azpiunitate batzuek laguntzen dutela uste da, pp1a-ren karboxi-terminaleko (C-terminaleko) eskualdetik askatutako hainbat nsp txiki barne, Mproren (coronavirus nsp5 eta arteria birus nsp4, hurrenez hurren).Familiaren babes espezifiko mugatua eta jarduera anitzak dituzte (10ââ12 erreferentzian berrikusi).
Duela gutxi, sekuentzia-motiboen ezaugarri bereziak dituen domeinu bat aurkitu da RdRp-ren ondoan dagoen amino-muturrean (N-muinean) habiatutako birus guztietan, baina ez beste RNA birusik (16).Bere kokapenaren eta nukleotidoen transferasaren (nukleosido monofosfato [NMP] transferasa) jardueraren arabera, domeinu honek NiRAN (Nestvirus RdRp-rekin erlazionatutako nukleotido transferasa) izena du.NiRAN-RdRp-en domeinu bikoitzeko konbinazioak nsp12 osatzen du Coronaviridae familian eta nsp9 Arterioviridae familian, eta beste nestoviridae batzuetan, NiRAN-RdRp poliproteina birikoaren nsp independente gisa askatzea espero da.Koronabirusan, NiRAN domeinuak ??1/450 hondakinak ditu eta C-terminaleko RdRp domeinuarekin lotuta dago lotura-eskualdearen bidez (16-19).Zaldi Arteritis Birusa (EAV) (Arteriviridae) nsp9 birkonbinatzaileak Mn2+ ioien menpeko (auto) UMPilazio eta GMPilazio jarduerak erakusten ditu, nestobirusa, AN, BN eta CN sekuentziako hondarretan kontserbatutako hiru sekuentzia-baseren araberakoak direnak.Non N NiRAN adierazten duen) (16).Motibo hauen N-terminal alboa preAN motibo ez hain kontserbadorea da.Hondakin horietako batzuk urrutiko erlazionatutako proteina kinasetan ere kontserbatzen dira, non frogatu den nukleosido trifosfatoaren (NTP) loturan eta jarduera katalitikoan parte hartzen dutela (20, 21).Behaketa honekin bat eginez, Pseudomonas syringae-ren SelO pseudokinasan dauden hainbat gune aktibo gako-hondarrak berriki argitaratutako SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 superkonplexuarekin munta daitezke.Kontserbatutako Coronavirus NiRAN hondakinak mikroegitura elektronikoan gainjarrita.Proteina birkonbinatzailea (17).Dokumentatutako (auto) U/GMPylation-ek NMP substratuari (gaur egun ezezaguna) transferitzeko egoera iragankorra sortuko duela uste da (16), eta NiRAN eta proteina kinasaren arteko antzekotasun estrukturala (17, 19) al da hipotesia. NiRANek beste proteina batzuk aldatzen ditu.
Ezaugarri askok, habiatutako birusekin duen elkarketa sistematiko paregabea eta RdRp-tik bereizketa genetikoa barne, NiRAN birus habiaratuetarako funtsezkoa den entzima erregulatzaile zentzuzko bihurtzen dute, eta hori funtsezkoa da haien agerpenerako eta identitaterako.Aurretik, genoma/subgenoma itzulpena edo erreplikazioa/transkripzioa erregulatzeko NiRAN inplikatzen duten hiru funtzio posible deitzen ziren.Garai hartan dauden datu eskas eta osatugabeak kontuan hartuta, funtzio bakoitzak bere abantailak eta desabantailak ditu (16).Ikerketa honetan, bi generoak ordezkatzen dituzten koronavirusen azterketa biokimikoak eta alderantzizko genetikoak uztartu nahi ditugu, eta gure aurkikuntzak koronavirusaren familiaren mutazio naturalaren eboluzio-hondoan jarri nahi ditugu, eremu Misteriotsu hau ezagutzeko.NiRAN-en ulermenean izandako aurrerapen handien berri ematen dugu RTCn helburu naturalak identifikatzearen bitartez, eta horrek (eskura daitezkeen hiru hipotesien artean) domeinu honek habiatutako birusaren RNAren sintesian abiaraztean duen zereginari laguntzen dio.Ikerketa honek NiRAN-en beste rol batzuetarako aukerak ere irekitzen ditu birusaren ostalariaren interfazean.
Koronabirusaren nsp12-rekin erlazionatutako NiRAN domeinuaren propietate entzimatikoak ezaugarritzeko, giza koronavirusaren 229E (HCoV-229E) nsp12 forma birkonbinatzailea sortu genuen E. coli-n, His6 etiketa batekin C-muinean, eta konbinatu genuen. [α32-P] duten proteina NTPrekin batera inkubatu MnCl2-ren presentzian Materialak eta Metodoak deskribatzen den moduan.Erreakzio-produktuaren analisiak nsp12-rekin (106 kDa) batera migratzen duen erradiomarkatutako proteina baten presentzia adierazi zuen, koronavirus nsp12-k proteina-NMP aduktu kobalenteen eraketa katalizatzen duela adieraziz, lehentasunez uridina monofosfatoarekin (UMP) (1A Irudia) eta B).Azterketa kuantitatiboak erakutsi zuen beste nukleotidoekin alderatuta, UMP barneratzeko seinalearen intentsitatea 2 eta 3 aldiz handitu zela (1C irudia).Datu hauek koronavirusaren NiRAN domeinuaren (16) aurreikusitako NMP transferasaren jarduerarekin bat datoz, baina koronavirusaren NiRAN domeinuaren eta birus arterialaren nukleotidoen hobespenak desberdinak direla adierazten du.
HCoV-229E nsp12-ren auto-NMPilazio-jarduera.(A) HCoV-229E nsp12-His6 (106 kDa) [α-32P] NTP izendatuarekin inkubatu zen 6 mM MnCl2-ren aurrean 30 minutuz (ikus Materialak eta metodoak xehetasunetarako).Erreakzio-produktuak SDS-PAGE bidez bereizi eta Coomassie urdin distiratsuarekin tindatu ziren.(B) Proteina erradiomarkatua fosforo bidezko irudien bidez ikusten da.Nsp12-His6 eta proteina-masa molekularreko markatzaileen posizioak (kilodaltonetan) A eta B-n agertzen dira. (C) Seinale erradioaktiboaren intentsitatea (batez bestekoa ± SEM) hiru esperimentu independenteetatik zehaztu zen.*P≤0,05.Seinalearen indarra (ehunekoa) UTPrekin lotuta dago.
NiRAN-ekin erlazionatutako entzimaren jarduerak ezinbestekoak direla frogatu bada ere zelula-kulturan EAV eta SARS-CoV erreplikatzeko (16), oraindik ez dira zehaztu NiRANen funtzio espezifikoa eta helburu potentzialak.Duela gutxi NiRANen eta proteina kinasa-itxurako tolesturak dituzten proteina-familia baten arteko antzekotasun estrukturalak (17, 22) NiRANek beste proteina batzuen NMPilazioa katalizatzen duen hipotesia probatzera bultzatu gaitu.Helburu homologo potentzial multzo bat sortu genuen, HCoV-229E ORF1a-k kodetutako proteina ez-egituralak barne (nsps 5, 7, 8, 9, 10), bakoitzak C-terminal His6 etiketa (SI eranskina, S1 taula) duena, eta proteina hauek [α32-P] uridina trifosfatoarekin ([α32-P]UTP) inkubatu nsp12ren presentzian edo ezean.Behi-serum albumina eta E. coli-n sortutako MBP-LacZα fusio-proteina kontrol gisa balio izan zuten (2A irudia, 1etik 7ra bitarteko bideak).Erradiomarkatutako proteina sodio dodecil sulfato-poliakrilamida gel elektroforesiaren bidez (SDS-PAGE) eta autoerradiografiaren bidez aztertu zen, eta nsp12 eta nsp9 zituen erreakzioan seinale erradioaktibo indartsua zegoela ikusi zen.Seinalearen posizioa nsp9-ren masa molekularrari dagokio, nsp9-ren nsp12 bidezko UMPylation adierazten duena (2B irudia, 7. pista).Ez zen beste probako proteinarik aurkitu UMPilatutakoik, eta horrek nsp9 nsp12-ren substratu espezifikoa dela ondorioztatu gintuen.1. Irudian agertzen diren auto-NMPilazio datuekin bat etorriz, nsp12 lau NMPak nsp9ra transferitzeko gai da, nahiz eta eraginkortasuna desberdina den, UMP> adenosina monofosfatoa (AMP)> guanosina monofosfatoa (GMP)> zitidina monofosfatoa (CMP)) ( Irudia).3 A eta B).Entsegu honetan erabilitako baldintzetan (erreakzio eta esposizio-denbora laburtu, nsp12-ren kontzentrazioa murriztu; materialak eta metodoak), ezin izan da nsp12-ren auto-NMPylation detektatu (konparatu 2B irudia, 7. erreia eta 1B irudia), zeina. eraginkorra izan da (Eta hainbat txanda) UMP nsp12-tik nsp9-ra pasa zen.UMP transferasaren jarduerak Mn2+ ioien presentzia eskatzen du, 3C irudian ikusten den moduan, Mg2+-ren aurrean UMP transferasaren jarduera minimoa baino ez zen ikusi, eta probatutako beste bi katioi dibalenteen aurrean jarduerarik ez.Zitidina trifosfatoa (CTP), guanosina trifosfatoa (GTP) eta adenosina trifosfatoa (ATP) (SI eranskina, S1 irudia) dituzten NMPylation entseguetan antzeko datuak lortu ziren.
HCoV-229E nsp12-ren bidez nsp9ren UMPilazioa.Proteina-substratu batzuk (behi-serum albumina, MBP-lacZα eta HCoV-229E nsps serie bat barne, ORF1a-k kodetutako C-terminal His6-rekin etiketatuta) erabili ziren HCoV-229E nsp12-His6⁺-ren bidezko UMPylation jarduera ebaluatzeko. proteina.Proteina [α-32P] UTPrekin inkubatu 10 minutuz nsp12ren (A) edo (B) presentzian, materialetan eta metodoetan deskribatutako moduan.A eta Bren goialdean, Coomassie Brilliant Bluez tindatutako SDS-poliakrilamida gela ageri da, eta A eta Bren behealdean, dagozkion autorradiogramak.Proteinaren masa molekular-markatzailearen posizioa (kilodaltonetan) ezkerrean ematen da.nsp12-His6-ren posizioa (B, goian) eta nsp12-His6-ren inkubazioan nsp9-His6-rekin (B, 7 erreia) ikusitako seinale erradioaktiboa ere adierazten dira, eta horrek adierazten du [α-32P]UMP-ra nsp9-His6-ra. (12,9 kDa), probatutako beste proteinetan ikusi ez dena.
HCoV-229E NiRAN-en bidez nsp9 NMPylation-en karakterizazio biokimiko eta birologikoa.(A eta B) Erreakzioan erabilitako kosubstratu nukleotidoaren eginkizuna.Nsp12-His6 eta nsp9-His6 nahastu eta inkubatzen dira [α-32P] NTP desberdinen presentzia NMPylation saiakuntza estandarrean.(A, goian) Coomassie-z tindatutako nsp9-His6 SDS-PAGE bidez bereizita.(A, behean) Gelaren eremu bereko autorradiografia.(B) Jarduera erlatiboa (batez bestekoa ± SEM) izendatutako kofaktore nukleotidoaren presentzian hiru esperimentu independenteetatik zehazten da.*P≤0,05.(C) Metal ioien eginkizuna.NMPilazio-test estandarra erakusten da [α-32P] UTP eta metal ioi desberdinen aurrean, bakoitza 1 mM-ko kontzentrazioarekin.C-n, goialdean, Coomassie tindatutako nsp9-His6 ageri da, eta C-n, behealdean, dagokion autorradiografia.Etiketatutako proteinaren tamaina (kilodaltonetan) A eta Cren ezkerraldean agertzen da. (D) Zehaztutako aminoazidoen ordezkapena daraman HCoV-229E nsp12-His6-ren forma mutantea [α-32P]UTPn dago, deskribatu bezala. Material eta Metodoetan.NMPylation erreakzioan sortutako nsp9-His6 erradiomarkatua fosforilazio irudien bidez detektatzen da (D, goian).Basa-mota (wt) proteinarekin alderatuta aktibitate erlatiboa D-n erakusten da, eta behealdea hiru esperimentu independenteen batez besteko (± SEM) gisa hartzen da.Asteriskuek kontserbatu gabeko hondakinen ordezkapenak adierazten dituzte.(E) Infekzioa egin eta 24 ordura lortutako p1 zelulen hazkuntza gaindiko birusaren titulua plaka-azterketa bidez zehaztu zen.HCoV-229E ingeniaritza mutantearen NiRAN domeinuko kodoien ordezkapenak adierazten dira (hondakinen zenbaketa pp1ab-en duten posizioan oinarritzen da).Erreplikazio-eskasa den RdRp gune aktiboko nsp12_DD4823/4AA mutantea kontrol gisa erabili zen.
NiRAN-en gune aktiboa sakonago ezagutzeko eta nsp9-ren NMP transferasa espezifikoaren jarduerarekin lotutako hondakinak zehazteko, mutazio-analisia egin genuen, eta bertan NiRAN AN, BN eta CN motiboetako hondakin kontserbadoreak ordezkatu genituen ( 16) Ala da (SI eranskina, S2 irudia).Horrez gain, Arg-to-Lys edo Lys-to-Arg ordezkapen kontserbadoreen eragina bi kasutan ebaluatu zen.Kontrol (negatibo) gisa, koronavirusen eta habiatutako beste birus batzuen NiRAN domeinuan edo gutxiago kontserbatzen ez diren hondakinak Ala-rekin ordezkatzen dira. K4116A (preAN motiboan), K4135A (AN), R4178A (BN), D4188A (arrea) ordezkatuz. BN) eta D4280A (CN) nsp9 NMPilazioa nabarmen murrizten edo ezabatzen dute nsp12 bidez, ordezkapen kontserbadorea duten proteinek (R4178K), K4116R) beren jardueraren % 60 eta % 80 mantentzen duten bitartean, eta horrek adierazten du dagokien aldean dauden murrizketen erlaxazioa. kateak fisikokimikoki sentikorra da (3D irudia).Kontserbatutako beste hainbat hondakin E4145A, D4273A, F4281A eta D4283A ordezkatzea askoz ere kaltegarria da, eta nsp9 UMPilazioa neurriz murrizten da.Antzeko emaitzak lortu ziren beste NTP batzuekin nsp9 NMPilazio-erreakzioetan (3D irudia eta SI eranskina, S3 irudia), aminoazidoen ordezkapen espezifikoetan ikusitako efektuak erabilitako nukleotido kosubstratu motatik independenteak direla baieztatuz.Ondoren, nsp12 ordezkapen hauek zelula-kulturan koronavirusen erreplikazioan izan dezaketen eragina probatu dugu.Horretarako, genetikoki landutako DNA osagarri (cDNA) txantiloi egokiak erabili ditugu vaccinia birus birkonbinatzailean klonatutako (23, 24) 5 -7 zelula transkribatzeko.Zelula horietan sortutako birus infekziosoen ondorengo tituluak erakutsi zuen HCoV-229E NiRAN mutante gehienak ez zirela bideragarriak (3E irudia).Bideragarriak ez diren mutante birikoen talde batek NMP transferasaren jarduera in vitro desagerrarazten edo nabarmen murrizten duela frogatu duten alternatibak biltzen ditu (K4116A, K4135A, R4178A, D4188A, D4280A, D4283A), baina badira beste bi alternatiba (K4116R, E41045A). % erreserbatuta?Haien in vitro NMPilazio-jarduerak murrizketa gehigarriak tartean daudela iradokitzen du.Era berean, beste bi mutaziok (R4178K, F4281A) NiRAN-en in vitro NMPilazio-jardueraren jaitsiera moderatua eragin zuten birus biziak sortu zituzten, hala ere, birus hauek tituluak nabarmen murriztu zituzten erreplikazioaren bidez.3D irudian ageri diren in vitro jardueraren datuekin bat, koronavirusetan eta/edo habiatutako beste birus batzuetan (K4113A, D4180A, D4197A, D4273A) (8, 16) kontserbatzen ez diren beste lau hondakin ordezkatuz (8, 16) birus bideragarriak sortu ziren Kumeak, izan arren. titulua neurrizko murriztua birus basatiarekin alderatuta (3E irudia).
NiRAN bidezko NMP transferasaren jarduera RdRp domeinu aktiboaren menpe dagoen ala ez aztertzeko, C RdRp motiboko metal dibalenteen ioien koordinazioan parte hartzen duten bi Asp hondakin kontserbatuak (11) Ala-rekin ordezkatu ziren. Sortutako proteina nsp12_DD4823/4AA mantentzen da. bere nsp9 NMPilazio-jarduera, nsp12-ren bidez in vitro nsp9 NMPilazio-jarduerak polimerasaren jarduerarik behar ez duela adierazten du (SI eranskina, S4 irudia).
Nsp9-n NMP transferasa-jarduera espezifikoa ezarri ondoren nsp12-rako, NMP-nsp9 aduktua masa espektrometriaren bidez (MS) karakterizatzen saiatu gara.HCoV-229E nsp9 birkonbinatuaren proteina-masa espektro osoak 12.045 Da-ko gailurra erakutsi zuen (4A irudia).Nsp12 gehitzeak ez zuen nsp9ren kalitatea aldatu, nsp12 eta nsp9-k ez zutela konplexu egonkorrik osatuko erabilitako baldintzetan (desnaturalizazioa) (4A irudia).UTP eta GTPren presentzian, hurrenez hurren nsp9 eta nsp12 dituen erreakzioaren masa neurtzeak UTP-ren proteina-masa 306 Da mugitzen zuela eta GTP-ren proteina-masa 345 Da mugitzen zela erakutsi zuen, nsp9 molekula bakoitzak UMP edo GMP bat lotzen duela adieraziz. (4. irudia) C eta D).NiRAN bidezko nsp9 NMPilaziorako behar den energia NTP hidrolisitik eta pirofosfato askapenetik datorrela uste da.Erreakzio honetan nsp9 (helburua) nsp12 (entzima) baino 10 aldiz molar-gehiegikeria erabili bazen ere, nsp9-ren NMPilazio ia osoa ikusi zen, nsp12 eta nsp9-ren arteko elkarrekintza iraupen laburra dela eta nsp12-k nsp9 gehiago NMPilatu dezakeela adieraziz. in vitro molekula.
nsp9-ren NMPilazio bakarra nsp12 eta UTP edo GTPren aurrean.HCoV-229E nsp9 (SI eranskina, S1 taula) (AD) proteina-masa espektro osoa dekonvolutatua erakusten da.(A) nsp9 bakarrik, (B) nsp9 + nsp12-His6, (C) nsp9 + nsp12-His6 UTPren aurrean, (D) nsp9 + nsp12-His6 GTPren aurrean.
Nsp12-k UMPilatutako nsp9 hondarrak zehazteko, nsp9-UMP tripsinarekin moztu zen.Ondorioz, peptidoak errendimendu handiko kromatografia likido nano (HPLC) bidez bereizi ziren eta sareko masa-espektrometria tandem bidez (MS/MS) aztertu ziren.Datuen analisiak Byonic software paketea erabiliz (Protein Metrics) N-terminaleko aminoazidoaren UMPilazioa erakutsi zuen.Hau eskuz baieztatzen da.[UMP]NNEIMPGK peptido aitzindariaren tandem masa-espektroak (SI eranskina, S5A irudia) 421 m/z-ko zati bat agerian utzi zuen, UMP nsp9-ren 1. hondakinarekin lotzen dela adieraziz.
Nsp9-ren N muturrean, Asn kontserbatzen da Orthocoronavirinae-ko kideen artean (SI eranskina, S6 irudia).N-terminaleko amina nitrogeno primarioa UMPren onartzaile seguruena dela uste badugu ere, NMP-ren loturaren froga osagarriak lortzea erabaki genuen N-terminalean.Hori dela eta, HPLC bidez araztutako NMPilatutako eta NMPilatutako N-terminal peptido nsp9 azetona eta sodio zianoborohidruroaren presentzian eratorri zen.Baldintza hauetan, amina primario askeak soilik alda daitezke propiloz (25).NNEIMPGK sekuentzia duen N-terminaleko nsp9-tik eratorritako peptidoak bi amina primario ditu, bata Asn-en N-muturrean eta bestea Lys-en albo-katean C-muinean.Beraz, bi muturretan propilo taldeak sar daitezke.NMPilatuak ez diren peptidoen ioi-kromatogramak SI eranskinean agertzen dira, S5B irudian.Espero bezala, N-terminala eta C-terminala (mono)propilatuak (SI eranskina, S5B irudia, goiko erreia) eta dipropilatutako peptidoak (SI eranskina, S5B irudia, beheko erreia) identifikatu daitezke.Eredu hau nsp9-ren NMPilatutako N-terminal peptidoaren erabilerarekin aldatzen da.Kasu honetan, C-terminaleko peptido propilatuak bakarrik identifikatu daitezke, baina N-terminaleko peptido propilatuak eta peptido dipropilatuak ez dira identifikatzen (SI eranskina, S5C irudia), UMP N-terminaleko amina primariora transferitu dela adieraziz Hori saihesteko. taldea aldaketak egiteko.
Jarraian, nsp9-ren N-muturrean kontserbatutako hondarrak ordezkatu (Ala edo Serrekin) edo ezabatzen ditugu xede-muga zehatzak definitzeko.Gure MS datuetan oinarrituta, NiRANek nsp9-NMP aduktu bat eratzen duela nsp9-ren N-terminaleko hondarraren amina primarioarekin, nsp9 NMPylation-ek nsp9 NMPylation birusaren proteasa (Mpro, nsp5) nsp9 N-terminaletik askatzeko behar duela uste dugu. bere poliproteinaren aitzindaria.Hipotesi hau probatzeko, nsp9 duen nsp7-11 proteina aitzindari bat ekoitzi dugu E. coli-n eta NMPylation test estandarra egin dugu [α-32P] UTP (materialak eta metodoak) aurrean.5A irudian (3. erreia) erakusten den moduan, ebaki gabeko nsp7-11 aitzindaria ez dago nsp12-rekin erradiomarkatuta.Aitzitik, nsp7-11 nsp5 birkonbinatzaileak aitzindaritik nsp9 (eta beste nsps) askatzeko mozten badu, nsp9-rekin migratzen duen proteina erradiomarkatua detektatzen da, gure ondorioa baieztatuz, NiRAN eta nsp9-NMP kobalenteen aduktuen eraketa N-Selektiboa. .Asn N-terminalaren amina primario terminala (3825 posizioa pp1a/pp1ab-n).Ondorio hau nsp9 konstrukzioa erabiltzen duten esperimentuek ere onartzen dute, N-muturrean hondakin gehigarri bat edo bi dituena.Bi kasuetan, NiRAN-en bidez nsp9-ren UMPylation ezabatu egin zen (SI eranskina, S7 irudia).Ondoren, 3825-NNEIMPK-3832 peptido-sekuentziatik ezabatutako Asn hondar bat edo bi dituen proteina bat sortu dugu nsp9-ren N-terminalean.Bi kasuetan, nsp9 UMPylation erabat blokeatu zen (5B irudia), benetako nsp9 N-muga NMP hartzaile gisa jokatzen duen froga gehigarria emanez.
Nsp9-ren prozesamendu proteolitikoa eta N-terminaleko hondakinen eginkizuna nsp12-ren bidezko UMPilazioan.(A) nsp9 UMPilazioak nsp9 N-terminal librea behar du.Nsp7-11-His6 aurrez inkubatzen da 30 °C-tan UTP duen NMPylation detekzio-buffer batean Mpro birkonbinatzailearen (nsp5-His6) presentzian edo ezean.3 ordu igaro ondoren, hasi NMPylation saiakuntza nsp12-His6 gehituz Materialak eta metodoak atalean deskribatzen den moduan.Kontrol gisa nsp5-His6 (1. erreia) eta nsp9-His6 (2. erreia) dituen erreakzioa erabili zen.10 minutu igaro ondoren, erreakzioa amaitu zen eta erreakzio-nahasketa SDS-PAGE bidez bereizi zen.Proteina Coomassie Brilliant Bluerekin (A, goian) tindu zen.Eskuinean Nsp7-11-His6 aitzindaria eta nsp5-His6 bidezko mozketatik eratorritako produktu prozesatua agertzen dira.Kontuan izan (tamaina txikia dela eta) nsp7 eta nsp11-His6 ez direla gel honetan detektatzen, eta erreakzioa nsp5-His6-rekin osatzen dela (1 eta 4 bideak; nsp5-His6-ren posizioa zirkulu solido batez adierazten da) edo nsp9-His6 (Lane 2) MBP kopuru txiki bat dauka (zirkulu irekiek adierazita) hondar ezpurutasun gisa, MBP fusio-proteina gisa adierazten direlako (SI eranskina, S1 taula).(B) Nsp9-His6 aldaerak N-terminal Asn hondar bat edo bi falta ditu (hondakinen zenbaketa pp1a/pp1ab-en posizioaren arabera) eta nsp12-His6 eta [α-32P] UTP-rekin araztu eta inkubatu egiten da.B, Coomassierekin tindatutako SDS-PAGE ageri da goialdean, B, dagokion autorradiografia behean.Pisu molekularren markatzailearen posizioa (kilodaltonetan) ezkerrean ageri da.(C) HCoV-229E nsp9-His6 N-terminaleko hondakin kontserbatuak Ala edo Ser-ekin ordezkatu ziren, eta proteina kopuru bera erabili zen nsp12-His6-ren bitartekaritza UMPylation erreakzioan.Erreakzio-produktuak SDS-PAGE bidez bereizi eta Coomassie Brilliant Blue-z tindatu ziren (C, goian), eta nsp9-His6 erradiomarkatua detektatu zen fosforeszentzia irudien bidez (C, erdikoa).Basa-mota (wt) proteina erreferentzia gisa erabiliz (% 100ean ezarrita), NMPilazio-jarduera erlatiboa (batez bestekoa ± SEM) hiru esperimentu independenteetatik kalkulatu zen.(D) HCoV-229E basati-mota Huh-7 zelulekin infektatutako Huh-7 zelulen p1 zelula-hazkuntza gaindikoaren birusaren tituluak eta nsp9-n izendatutako aminoazidoen ordezkapenak daramatzaten mutanteak plaken azterketaren bidez zehaztu ziren.Erreplikazio-eskasa den RdRp motibo C DD4823/4AA mutante bikoitza kontrol negatibo gisa erabili zen.
Nsp9-ren N-muturra (batez ere 1, 2, 3 eta 6 posizioak) oso kontserbatuta dago Orthocoronavirinae azpifamiliako kideen artean (SI eranskina, S6 irudia).Hondakin hauek nsp12-ren bitartez nsp9 NMPylation-an izan dezaketen eginkizuna aztertzeko, nsp9-ren N-mugainean dauden bi Asn hondakin jarraian Ala edo Ser-ekin ordezkatu ziren (bakarrik edo konbinatuta).Nsp9 basatiarekin alderatuta, N3825 Ala edo Ser-ekin ordezkatzeak nsp12-ren bidezko UMPilazioa bi aldiz murriztu zuen (5C irudia).Gure ondorioarekin bat eginez, NMPilazioa N-terminaleko amina primarioan gertatzen da N-terminaleko hondakinaren alboko katearen ordez, NMPilazio hondar esanguratsua ikusi dugu N3825A eta N3825S ordezkatuz.Interesgarria da bigarren Asn Ala edo Ser ordezkatzen bada, nsp9 UMPilazioa indartsuago murrizten da (10 aldiz baino gehiago), Ala ordezkatzeak 3, 4 eta 6 posizioetan nsp9 UMPilazioan eragin moderatua besterik ez duen bitartean (2. Irudia). ) .5C).Antzeko emaitzak lortu dira ATP, CTP edo GTP erabiliz (SI eranskina, S8 irudia).Kolektiboki, datu hauek N2826 (2. posizioa nsp9-n) nsp9 NMPylation-en funtsezko eginkizuna adierazten dute.
Nsp9-ren N-muturraren eta NMPylation-aren arteko korrelazio funtzionalaren froga osagarriak lortzeko, koronabirusaren familiako nsp9 sekuentziaren sekuentzia anitzeko lerrokadura (MSA) egin genuen (104 eta 113 hondakinen artean aldatuz) (SI eranskina, irudia). S6).Guztira, ugaztun, hegazti eta narrasti ostalari desberdinak infektatzen dituzten Orthocoronavirinae azpifamiliako 5 generotako 47 (ezagunak eta ustezkoak) espezietan, guztira 8 hondakin baino ez ziren aldaezinak aurkitu.Aldaketarik zabalenak, ezabaketak eta txertaketak barne, nsp9-ren bigarren mailako egitura-elementuen arteko zikloetan ikusi ziren, aurreko egitura-ikerketek zehazten zuten moduan (26 ??28).Bost hondakin aldaezin aurkitu ziren nsp9-ren C-terminaleko β katean eta α helizean.Hiru hondar aldaezinek nsp9-ren N muturreko NNE motiboa osatzen dute.Agerian dago motibo honen bigarren Asn aldaezina den hondar bakarra dela, urrutiko erlazionatuta dagoen igel koronavirusaren nsp9 hipotetikoak ere partekatzen duena, eta Alphaletovirusen Letovirinae azpifamiliako Microhyla letovirus 1 espeziea adierazten du.Nsp9 egitura sekundarioko elementuetan hondakinen kontserbazioa egitura-gogoeten bidez arrazionalizatu daiteke, tolestura edo RNA lotura-propietate ezagunak mantentzeko.Dena den, badirudi arrazoibide honek ez duela NNEren kontserbazioari aplikatzen, eta ikerketa hau egin aurretik, tripeptido-sekuentziaren aldakuntza mugatzen duten murrizketen izaera guztiz ilundu zen.
Koronabirusaren erreplikazioan nsp9-NMPylation eta NNE kontserbazioaren garrantzia zehazteko, HCoV-229E mutanteak ekoitzi ditugu, nsp9 N-terminaleko hondakinen ordezkapen bakar edo bikoitzak dituztenak, nsp9 NMPylation in vitro kaltegarria dela adieraziz.Hasi baino lehen, ordezkapen hauek (nsp8|9 ebaketa gunetik gertu) C-terminal pp1a eskualdearen prozesamendu proteolitikoan eragiten duten galderari erantzuten saiatzen gara.Nsp9-ren N-muturrean dagozkien ordezkapenak dituzten nsp7-11 poliproteina-eraikuntza multzo bat E. coli-n ekoiztu eta Mpro birkonbinatzailearekin moztu zen.Lau guneen zatiketa proteolitikoa (nsp9 alboko gunea barne) ez du eragin nabarmenik sartutako ordezkapenek (SI eranskina, S9 irudia), Mpro-ren bidez nsp8|9 mozketa oztopatzen duten proteina horien egitura-aldaketak alde batera utzita (Edo beste) webgunea.
Huh-7 zelulak genomaren luzera duen HCoV-229E RNArekin transfektatu ziren, NNE tripeptido kontserbatuetan (N3825, N3826 eta E3827) nsp9 N muturrean Ala edo Ser ordezkapenak kodetuz, mutazio gehienak hilgarriak direla erakutsiz.Birusa erreskatatu ahal izan dugu N-terminaleko Asn-aren Ser edo Ala (N2835A edo N2835S) ordezkatuz, baina ezin izan dugu birusa berreskuratu NNE sekuentzian beste mutazio bakar eta bikoitz batzuekin (N3826A, N3826S, NN3825/6AA, NN3825/6SS) , E3827A) (5D irudia).
Emaitza hauek adierazten dute ehun-kulturan koronavirusen erreplikazioa mugatuta dagoela (berdina edo antzekoa), gorputzeko nsp9 NMPilazio guneen mutazio naturala mugatuz eta erantzun horrek koronavirusen bizi-zikloan duen funtsezko eginkizuna onartzen duela.
Azken esperimentu-multzoan, SARS-CoV-2 nsp12 eta nsp9 etiketatutako His6 C-terminal eta E. coli-n nsp12 mutante bi ekoiztu genituen.NiRAN eta RdRp domeinuetako gune aktiboen hondakinak Erabili Ala izan ziren (6A irudia eta SI eranskina, S2 taula).SARS-CoV-2 nsp12-n K4465 HCoV-229E-n K4135-ri dagokio (SI eranskina, S2 irudia), NiRAN jarduerarako eta HCoV-229E erreplikaziorako beharrezkoa zela frogatu zen (3D eta E irudia).Hondakin hori arteria birusaren EAV nsp9 K94 hondakinari dagokio, aurretik NiRAN auto-UMPilazio/auto-GMPilaziorako beharrezkoa zela frogatu zena (16).6B irudian erakusten den bezala, SARS-CoV-2 nsp12-k UMP transferasa jarduera du nsp9 substratu gisa erabiliz, nsp12_K4465A gune aktiboko mutantea inaktibo dagoen bitartean.RdRp motibo C-ren SDD ezaugarri sekuentzian ordezkapen bikoitzak ez du UMP transferasaren jardueran eragiten (6B irudia), RdRp jarduerak ez duela eragin zuzenik nsp9 UMPilazioan.Antzeko datuak CTP, GTP eta ATP erabiliz lortu dira (SI eranskina, S10 irudia).Laburbilduz, datu hauek adierazten dute NiRAN-en bidez nsp9 NMPylation-ek jarduera kontserbadorea duela ortocoronabirus azpifamiliako genero desberdinak ordezkatzen dituzten koronavirusetan.
SARS-CoV-2 nsp12-ren bidez nsp9-ren NMPilazioa.(A) Coomassie zikindutako SDS-poliakrilamida gela NMPylation proban erabilitako proteina birkonbinatzailea erakutsiz.Kontrol gisa, SARS-CoV-2 nsp12-ren NiRAN (K4465A) eta RdRp domeinuan (DD5152/3AA) gune aktiboaren ordezkapena duen proteina mutante bat erabili zen.Hondakinen zenbaketa pp1ab-eko posizioan oinarritzen da.(B) UMPylation detektatzeko autorradiografia nsp9-His6 eta [α-32P]UTP nsp12-His6-ren substratu gisa erabiliz ([wt] eta mutante basatia).Etiketatutako proteinaren masa molekularra (kilodaltonetan) ezkerrean agertzen da.
NiRAN domeinuak, oro har, Nidovirales-en kontserbatzen dira (16), Nidobirusaren erreplikaziorako ezinbestekoak diren erreakzio entzimatikoak katalizatzen dituztela adieraziz.Azterketa honetan, koronavirusaren NiRAN domeinuak NMP (NTPtik sortutakoa) nsp9ra transferitzen duela frogatu ahal izan dugu, birusen erreplikazioan parte hartzen duen RNA loteslearen proteina misteriotsu bat (26 ?? 29), helburu natural gisa zehazteko eta koronavirus RTCren bazkidea.
NiRAN domeinuak hiru sekuentzia-motibo partekatzen ditu (AN, BN eta CN), familia guztietan kontserbatzen diren hondakin kopuru oso txikia dutenak Nidovirales ordena monofiletiko baina oso desberdindua (8, 16).Azken ikerketek frogatu dute egituraz erlazionatuta daudela gehien ezaugarritu gabeko proteina kinasa-itxurako proteinen familia batekin, jatorrian SelO familia deitua (17, 19, 22, 30, 31).SelO-rekin erlazionatutako proteinek kinasa tolesturak dituzte, baina kontserbatutako hainbat gune aktibo hondakin falta dituzte kinasa klasikoetan (22, 32).Gune aktiboari loturiko eta interakzio espezifikoen bidez egonkortutako ATP molekulen alderantzizko orientazioan oinarrituta, SelO hipotesia egin zen eta, ondoren, AMP (fosfatoaren ordez) proteina-substratura transferitzen zuela baieztatu zen (22), eta beste bakterio SelO antzeko proteina YdiU-k duen bitartean. duela gutxi frogatu da UMP-ren atxikimendu kobalentea katalizatzen duela proteina-substratu desberdinen Tyr-ekin eta His-ekin (33).
NiRAN koronavirusaren domeinuko gune aktiboko hondakinen iragarpena baieztatu eta zabaltzeko, biokimikoak eta alderantzizko genetika metodoak erabili ditugu koronavirus nsp12-ren mutazio-analisia egiteko (3D irudia eta E eta SI eranskina, S3 irudia eta taula) S1â S4).Datuek erakusten dute HCoV-229E K4135, R4178 eta D4280 Ala-rekin ordezkatzeak in vitro NMP transferasaren jarduera eta birusen erreplikazioa ezabatzen dituela zelula-kulturan (3D irudia eta E eta SI eranskinak, S3 irudia), NTP γ-fosfatoan duten presentzia onartzen duela. (K4135, R4178) eta gune aktiboko metal ioien koordinazioa (D4280).K4135 (17) posizioa egonkortzeko aurreikusitako hegazti-habiaren birusaren barrutian kontserbatutako Glu-ren E4145A ordezkatzeak erreplikazio birikoa ezabatzen zuela frogatu zen, baina harrigarria bada ere, jarduera in vitro NMPylation entseguan mantendu zen (3D eta E irudia eta SI eranskina, S3 irudia eta S1–S4 taulak).Antzeko behaketa egin zen Salmonella typhimurium (E130A) YdiU homologoan dagokion ordezkapena sartu zenean (33).Batera hartuta, datu hauek kontserbatutako hondakin honen funtzio erregulatzailea onartzen dute, funtzio katalitikoa baino.
HCoV-229E NiRAN domeinuan (8) nestobirusen barrutian kontserbatutako Phe hondarra (F4281A) ordezkatzeak (8) NMPilazio-jarduera gutxitu egin zuen in vitro eta birusaren erreplikazioa zelula-kulturan nabarmen murriztu zen (3D, E eta SI irudia) eranskina, S3 irudia).Datuak bat datoz hondakin honen erregulazio-funtzio garrantzitsuarekin, hala nola, lehen erakutsitako DFG motibo homologoko Phe hondakinarekin.Proteina kinasa klasikoetan, Mg2+ lotura-begiztaren parte da eta bizkarrezurra muntatzen eta erregulatzen laguntzen du???Jarduera katalitiko eraginkorra izateko beharrezkoa da (32, 34).Ala eta Arg K4116 hondakinak ordezkatuz (preAN motiboan), hurrenez hurren, erreplikazio birikoa ezabatu zuen eta, espero bezala, NMP transferasaren jardueran in vitro eragin desberdinak izan zituen, sartutako albo aminoazidoen katearen arabera (3D eta E eta SI eranskinen irudia). , S3 irudia).Datu funtzionalak egiturazko informazioarekin bat datoz, hondakin horrek ATP fosfatoarekin elkarrekintza ezarri duela adierazten du (17).Habiaturiko beste birus-familia batzuen NiRAN domeinuan, HCoV-229E pp1a/pp1ab K4116-ren posizioa Lys, Arg edo His-ek (8) hartzen du, hondar espezifiko horren murrizketa funtzionala lasaitu egin dela adieraziz.D4188A eta D4283A ordezkatzeak entzimaren jarduera kentzen edo asko murrizten du eta birusen erreplikazioa ezabatzen du (3. irudia).Bi hondar horiek habiatutako birus gehienetan (baina ez guztietan) kontserbatzen dira (8), familia-bereziki garrantzitsua den baina, agian, funtzio katalitikoa ez dena adierazten dutenak.Kontrol gisa erabili ziren Coronaviridae edo beste Nestioviridae familietan (8) kontserbatzen ez diren beste hainbat Lys eta Asp hondakinen (K4113A, D4180A, D4197A eta D4273A) ordezkapenak.Espero zen bezala, ordezkapen hauek jasangarriak dira neurri handi batean, entzimaren jarduera eta biralaren erreplikazioa apur bat gutxitu baita kasu batzuetan (3. irudia eta SI eranskina, S3 irudia).Orokorrean, koronavirusaren mutagenesiaren datuak oso koherenteak dira EAV NiRAN-RdRp (16) auto-GMP eta alderantzizko genetikaren datuekin, zeinetan EAV nsp9 (coronavirus nsp12 ortholog) K94 hondakina (HCoV- 229E K4135-ri dagozkionak) funtzio garrantzitsuak), R124 (R4178-ri dagokiona), D132 (D4188-ri dagokiona), D165 (D4280-ri dagokiona), F166 (F4281-ri dagokiona).Horrez gain, HCoV-229E mutagenesiaren datuak bat datoz eta aurretik jakinarazitako SARS-CoV alderantzizko genetikaren datuekin (16) hedatu egiten dira, dagokion CN motibo Phe-to-Ala SARS-CoV_nsp12 mutantearekin ikusitakoen antzera. deskribatutako fenotipoa -F219A eta HCoV-229E_F4281A (3. irudia D eta E eta SI eranskina, S3 irudia eta S1-S4 taula).
EAV ortologoekin alderatuta (16), UTP eta GTP (auto-NMPylation erreakzioan) lehentasun argia dutenekin alderatuta, gure ikerketak erakusten du koronavirus NiRAN domeinua (HCoV-229E eta SARS-CoV-2-k ordezkatuta) eraginkorra izan daitekeela. transferitu dira lau NMPak, nahiz eta UMPrako lehentasun apur bat dagoen (1 eta 3. irudiak).NTP ko-substratu espezifikoaren espezifikotasun nahiko baxua bat dator berriki jakinarazitako SARS-CoV-2 nsp7/8/12/13 egitura superkonposatuarekin, zeinetan ADP-Mg2+ NiRANen gune aktiboarekin lotzen den, baina ez adeninarekin. interakzio espezifikoen eraketaren (17).Gure ikerketan, NMPylation erreakzioan erabilitako nukleotido motak ez du eragin diferentzialrik proteina mutantearen jardueran (SI eranskina, S3 irudia), eta horrek adierazten du hondakin horietako bat ere ez dagoela estuki erlazionatuta nukleobase jakin baten loturarekin.Koronavirusen eta birus arterialen NiRAN domeinuetan ikusitako NTP ko-substratu-hobespen desberdinen egitura-oinarria eta esangura biologiko potentziala aztertzeko dago;egiazkoak izan daitezke edo dagozkien ikasketen mugengatik izan daitezke.Gaur egun, ezin da baztertu arteria birusaren NiRAN domeinuaren NMPylator jarduera potentzialak (aurretik karakterizatutako auto-NMPilazio jarduerarekin alderatuta) kosubstratu-hobespen desberdina izatea, kontuan hartuta arteriaren eta koronavirusaren arteko antzekotasuna. NiRAN domeinua bere mugan dago.Sekuentzian oinarritutako alderaketa (16).Mg2+ kofaktore gisa erabiltzen duen SelO pseudokinasarekin alderatuta, koronavirusaren eta NiRAN birus arterialaren jarduera Mn2+-ren menpe dago (16) (3C irudia eta SI eranskina, S1 irudia).Mn2+ menpekotasuna eta UTPren lehentasun nabaria proteina NMPylators-en ezohiko ezaugarria da, eta duela gutxi baieztatu da Salmonella typhimurium-en YdiU proteinan, Mn2+ menpeko proteina txaperonaren UMPylation zorrotza katalizatzen duena, zelulak estresaren indukziotik babesteko ATP zelulen multzoa ( 33).
Duela gutxi deskribatu den koronavirusaren NiRAN domeinuaren eta proteina kinasen zelulen arteko antzekotasun estrukturalak (17, 19) laguntza gehigarria ematen dio NiRANek NMP kobalenteki lotzeko gaitasunari ikerketa honetan jakinarazi ditugun beste proteina batzuekin.NiRAN helburu posibleen bilaketa HCoV-229E ORF1a-k kodetutako proteinetan zentratu genuen, RTC-ren ORF1b-en kodetutako erreplikasa zuzenean edo zeharka laguntzen dutela ezaguna (12, 35).Gure esperimentuek nsp9-ren NMPylation eraginkor eta espezifikoaren froga erabakigarriak eskaintzen dituzte (2. Irudia).Xede-proteina entzimaren (nsp12) baino 8 eta 10 aldiz handiagoa den gehiegizko molar batean erabiltzen bada, nsp9 guztiz (mono)NMPizatuta dagoela baieztatzen da (4. irudia).nsp12 eta nsp9-ren arteko elkarrekintza iraupen laburra dela ondorioztatu dugu eta ez duela konplexu egonkorrik osatuko nsp9rekin (beste RTC azpiunitaterik ezean).Ondorio hau SARS-CoV proteomaren proteina-interakzio ikerketek onartzen dute (35).MS analisiak nsp9-ren N-terminal hondakinaren amina primarioa NMPylation gune gisa identifikatu zuen (SI eranskina, S5 irudia).Fosforamido-lotura eta N-terminako amino-taldearen sorrerak NiRAN-en bitartez NMPilazio-jarduera bereizten du Pseudomonas syringae-ren SelO-ren bidezko AMPilazio-erreakziotik, zeinak O-lotutako AMParen eraketa katalizatzen du Ser, Thr edo Tyr hondar peptidoen aduktuan ( 22), eta S. typhimurium YdiU-k O-lotutako (Tyr-ekin) eta N-lotutako (His-ekin) peptido-UMP aduktuak eratzen ditu.SelO proteina-familiari buruz eskuragarri dagoen informazio mugatuak adierazten du proteina-familia handi horretako kideak oso desberdinak direla peptido-NMP aduktuen eraketan.Behaketa interesgarria da, eta gehiago aztertzea merezi du.
Azterketa honetan lortutako datuek nsp9-ren NMPylation-ak N-termina librea behar duela hipotesia egitera eraman gaitu.Erreplikazio birikoaren testuinguruan, hau Mpro eta pp1ab-ek medio erreplika poliproteina pp1a nsp8|nsp9 prozesatzeko gunearen mozketa proteolitikoak emango du.Koronabirus gehienetan, gune zehatz honen (VKLQ|NNEI HCoV-229E-n) eta beste koronavirus Mpro zatiketa gune guztien arteko aldea Asn da (beste hondakin txiki batek, hala nola Ala, Ser edo Gly) okupatzen du P1â???Kokapena (36).Lehen ikerketetan lortutako peptidoen mozketa-datuek nsp8|nsp9 gunearen mozketa-eraginkortasuna beste gune batzuena baino txikiagoa zela erakutsi zuten, 1) gune espezifiko honek C-terminalaren prozesamendu koordinatu egokian erregulazio-eginkizuna izan dezakeela adieraziz. pp1a eskualdea, edo 2) a Birusen erreplikazioan kontserbatutako nsp9 N-mutur bereziaren papera (37).Gure datuek (5A irudia) erakutsi zuten N-terminal sekuentzia erreala daraman nsp9-ren forma birkonbinatzailea nsp12-k eraginkortasunez NMPizatu zuela.N-terminalaren alboko sekuentzia Xa faktorea (nsp9-His6; SI eranskina, S1 taula) edo Mpro-ren bidezko mozketa (nsp7-11-His6; 5A irudia eta SI eranskina, S1 taula) kendu zen.Garrantzitsuena, ebaki gabeko nsp9-ren aitzindariak nsp7-11-His6 nsp12-ren NMPilazioarekiko erresistentzia erakutsi zuen, gure datuekin bat datorrena, nsp9-NMP aduktua N-terminaleko amina primarioaren bidez eratzen dela adieraziz (SI eranskina, S5 irudia) .NiRAN substratuaren espezifikotasuna sakonago ezagutzeko, ondoren nsp9-ren ondoko N-terminaleko hondakinetan zentratu ginen.Beste proteinarik ezean, estrukturalki malguak dira, eta nsp9-ren etiketarik gabeko forman detektatzea eragozten du (26 28, 38), haien aldakuntza natural mugatua adierazten duena. nsp9 N-terminal zatiaren funtzioa.Eskualde honetan kontserbatutako hondakinen Ala ordezkapenek (5C eta D irudiak eta SI eranskina, S8 irudia) agerian uzten dute N3826 ezinbestekoa dela nsp9 NMPilazio in vitrorako, N3825A eta E3827A ordezkapenek NMPilazioa gutxitzea eragiten duten bitartean, M3829A eta P3830A ordezkapenek ez duten bitartean. .Jakina, nsp9 NMPylation eragina du.N-terminaleko Asn (N3825A, N3825S) ordezkatzeak nsp9 NMPilazioan eta birusaren erreplikazioan zelula-kulturan eragin moderatua duen arren (5C eta D irudia), N-terminaleko 3825-NN dipeptidotik Asn hondakin-sekuentzia bat ezabatzeak. frogatu da Birusentzat hilgarria da, N-muturrean beste hondakin baten aurretik Asn hondar bat behar dela adieraziz, hobe Asn, nahiz eta badirudi antzeko hondakinen ordezkapena partzialki onartu daitekeela (5B, C eta D irudia).Ondorioztatu dugu 3825-NN dipeptidoak, batez ere koronavirusaren barruko N3826 hondakin kontserbatu eta ezinbestekoak (SI eranskina, S6 irudia), nsp9 N-mugarraren lotura eta orientazio zuzena bermatzen duela NiRANen gune aktiboan.
Azpifamilia guztien Glu kontserbatuaren Ala (E3827A) ordezkatzean nsp9 NMPilazioa in vitro mantentzen da, baina zelula-kulturan birusentzat hilgarria da (5C eta D irudia), hondakin honen funtzio gehigarria adieraziz, adibidez, funtsezko interakzioetan (NMPilatua edo aldatu gabea). ) nsp9 N-muturra eta birusaren erreplikazioan parte hartzen duten beste faktore batzuk.Nsp9 mutazioek ez zuten eraginik izan nsp9-ren edo ondoko nsp-en (39) prozesu proteolitikoan (SI eranskina, S9 irudia), eta adieraziz ikusitako hainbat nsp9 mutazioren fenotipo hilgarriak ez ziren C proteolitiko prozesu-terminal pp1a eremuaren disregulazioak eragin. .
Goiko datuek froga ematen dute pp1a/pp1ab-en nsp8|9 ebaketa gunearen Mpro bidezko tratamenduaren ondoren, nsp9-ren N-muturra UMPilatu daitekeela (edo partzialki aldatu daitekeela beste NMP batekin).Horrez gain, nsp9-ren N-mugarraren kontserbazio bikainak (koronavirusen familiako Asn hondar singular eta aldaezinak barne) eta ikerketa honetan lortutako alderantzizko genetikako datuek (3E eta 5D irudiak) deskribatutako nsp9 NMPilazioa ondorioztatu gaituzte. biologikoki erlazionatuta dago eta ezinbestekoa da koronavirusaren erreplikaziorako.Aldaketa honen ondorio funtzionalak aztertzeke daude, adibidez, aurretik deskribatutako (ez-espezifikoa) nsp9 (modu gabeko forma) RNA lotura-jarduerari dagokionez (2628).N-terminaleko NMPilazioak nsp9-ren interakzioan ere eragina izan dezake proteina edo RNA substratuekin edo lau mailako multzo ezberdinen eraketan.Hauek egiturazko ikerketetan ikusi dira eta koronavirusaren erreplikazioarekin funtzionalki erlazionatuta daudela baieztatu da, batez ere aldaketa honen kasuan (26- ââ29, 40) ez dagoen arren.
NiRAN koronavirusaren domeinuaren xede-zehaztasuna oraindik zehatzago ezaugarritu behar bada ere, gure datuek erakusten dute koronavirus-NiRAN domeinuaren xede-proteina-berezitasuna oso estua dela.Nidobirusen familia guztien NiRAN domeinuko gune aktibo gakoen (8, 16) kontserbatzeak NMPylator kontserbatutako proteina horien jarduera oso onartzen duen arren, domeinu honen substratu lotzeko poltsikoko hondakinen identitatea ezaugarritu gabe dago. , eta Nidovirales helburuen familia ezberdinen artean desberdina izan daiteke.Era berean, habiaratutako beste birus batzuen xede garrantzitsuak zehaztu gabe daude oraindik.Nsp9 edo beste proteina batzuen urruneko ortologoak izan daitezke, habiatutako birusetan orokorrean kontserbatzen diren bost erreplika-domeinuetatik kanpoko sekuentziak gutxiago kontserbatzen direlako (8), Mpro eta NiRANen arteko genoma array barne. Horien artean, nsp9-n kokatzen da. korona birusa.
Horrez gain, gaur egun ezin dugu baztertu NiRAN domeinuak helburu osagarriak (zelularrak barne) dituena.Kasu honetan, aipatzekoa da sortzen ari diren proteina NMPylators (NMPylators) (NMPylators) (30, 31) bakterio homologoek "erregulatzaile nagusiak" dituztela dirudiela?NMP-k hainbat proteina zelula modulatzen ditu beherako jarduerak erregulatzeko edo ezabatzeko, eta, ondorioz, hainbat prozesu biologikotan parte hartzen du, hala nola, estres zelularreko erantzuna eta redox homeostasia (22, 33).
Ikerketa honetan (2 eta 4. irudiak eta SI eranskina, S3 eta S5 irudiak), nsp12-k UMP (NMP) zatia nsp9-n posizio bakar batera (kontserbatuta) transferitzen zuela frogatu ahal izan genuen, beste proteinak ez ziren bitartean aldatu. erabilitako baldintzetan, ondo definitutako (soltea baino) substratuaren espezifikotasuna onartzen da.Honekin bat, N-terminaleko nsp9 NMPylation-arekin alderatuta, nsp12-ren NMPylation jarduera propioa oso baxua da, bere detekzio autoerradiografiaren esposizio-denbora luzeagoa behar da eta nsp12 kontzentrazioa 10 aldiz handitzea erabiltzen da.Horrez gain, gure MS analisiak ez zuen nsp12-ren NMPilaziorako frogarik eman, eta horrek iradokitzen du NiRAN domeinuaren auto-NMPilazioa (onenean) bigarren mailako jarduera dela.Hala ere, kontuan izan behar da beste ikerketek NMPylator bakterioen auto-AMPilazio-egoerak beste proteina-substratu batzuetan beren NMPilazio-jarduera kontrola dezakeela frogatu dutela (22, 33).Hori dela eta, ikerketa gehiago behar dira EAV nsp9 (16) eta koronavirus nsp12 (azterketa hau) auto-NMPilazio jardueren efektu funtzionalak ikertzeko, C-terminal RdRp domeinuaren tolestean proposatutako chaperonaren antzeko efektua barne ( 16)).
Aurretik, NiRAN domeinu nidobiralaren beheranzko funtzio posibleei buruzko hainbat hipotesi kontuan hartu dira, besteak beste, RNA ligasa, RNA-capped guanyllate transferasa eta proteina-aktibitatea (16), baina horietako bat ere ez da bateragarria beheran dauden funtzioekin.Ondorengo posizioetan lortutako informazioa aldi berean da, hipotesi gehigarririk egin gabe.Ikerketa honetan lortutako datuak bat datoz (baina ezin dute frogatu) NiRAN domeinuak proteinak eragindako RNA sintesian abiaraztean parte hartzen duela.Aurretik uste zen NiRAN domeinuaren funtzioa 5??²-RNA estaldura edo RNA ligatzeko erreakzioek ez dute eragiten datu hauek eta beste datu batzuen laguntzak.Hori dela eta, adibidez, NiRAN-en gune aktiboan kontserbatutako Asp oinarri orokor gisa hartzen da (D252 Pseudomonas syringae SelO-n; D4271 HCoV-229E pp1ab-en; D208 SARS-CoV-2 nsp12-n) (SI eranskina, 2. irudia). ).S2) (17, 22, 33), ATP-menpeko RNA ligasaren eta RNA estaltzeko entzimaren katalisia, berriz, (lisil-N)-NMP entzima kobalentearen bidez egiten da, Aldatu gabeko Lys hondar bat dakar ( 41).Horrez gain, NiRAN koronavirusaren sekuentzian oinarritutako espezifikotasun nabarmenak kontserbatutako proteina-helburuetarako eta NTP ko-substratuetarako erlaxatutako espezifikotasunak (UTP nahiago du) NiRAN bidezko entzimaren edo RNA ligasa antzeko funtzioen aurka egiten du.
Jakina, aparteko lan asko behar da nsp9-UMP (nsp9-NMP) proteinak eragindako RNA sintesian izan dezakeen eginkizuna egiaztatzeko eta, frogatzen bada, lantzeko, aurrez jakinarazitako hainbat txosten interesgarri baina (orain arte) lotuko dituena. .Behaketa isolatuak.Adibidez, koronavirusaren ARN negatiboaren amaiera oligo(U) kate batekin hasten dela zehaztu da (42, 43).Behaketa hau koherentea da kate negatiboko RNAren sintesia nsp9-ren UMPilatutako forma poli(A) isatsari (abiarazleak) lotuz hasten dela dioen ideiarekin, eta horrek bere RNA-ren loturarekin susta daiteke. Jarduera eta/edo elkarrekintzarekin beste RTC proteina bat.Nsp9-k emandako UMP zatia nsp7/8/nsp12-ren bidezko oligouridilaziorako "primer" gisa erabil daiteke, ARN genomikoan 3??²-poli(A) isatsa edo beste oligo (A) duen sekuentzia erabiliz. txantiloi gisa balio du, picornavirus VPg proteinarentzat ezarritako mekanismoaren antzera (44).Zer gertatzen da proposamena "ez-arauzkoa" bada????Hari negatiboko RNA (proteinek eragindako) sintesiaren hasierak behaketekin lotura bat eskaintzen du, koronavirusaren kate negatiboko RNAak bere amaieran UMP (UTP-aren ordez) duela adierazten duena (42), eta horrek adierazten duela uste da. azido nukleikoak Dicer-ek uridinaren espezifiko endonukleasa ezezagun batek fosforilatutako muturra mozten du.Baieztatzen bada, azido nukleikoko jarduera hidrolitiko honek nsp9-ren UMPilatutako forma oligomerikoa askatzen lagun dezake hari negatibo jaioberriaren 5 ²-ko muturretik.Nsp9-k proteina-hasketan izan dezakeen eginkizuna bat dator aurreko alderantzizko genetikako ikerketekin ere, zeinek erakutsi baitute nsp9 (eta nsp8) modu kritikoan eta zehazki elkarreraginatzen dutela koronavirusaren genomaren 3. muturrean dagoen cis jarduteko RNA elementu kontserbatuarekin.45).Txosten honen arabera, orain aurreko behaketa hauek berriro aztertu eta zabal daitezke ikerketa gehiagoren bidez.
Laburbilduz, gure datuek N-muturrean RdRp-ri lotuta dagoen habiaraturiko birus entzima etiketa baten jarduera espezifikoa zehaztu zuten.Koronavirusetan, aurkitu berri den NiRAN-en bitartekaritza UMPylator/NMPylator jarduera hau Mn2+ eta aldameneko Asn hondarretan oinarritzen da eta N-terminaleko amina primarioarekin (energia baxuko) fosforamidato loturak sortzea eragiten du.Mpro-ren bidez nsp8|9 mozketa gunearen bidez, nsp9 xedea NMPilaziorako erabil daiteke, proteasaren eta RdRp-era hedatzen den NiRAN domeinuaren arteko akoplamendu funtzionala adieraziz.Nsp12 NiRAN gune aktiboko eta nsp9 xedeko hondakin gakoen kontserbazioak, SARS-CoV-2 barne bi koronavirusetatik lortutako datuekin konbinatuta, froga sendoak ematen ditu nsp9 NMPylation koronavirus bat dela.Eskuragarri dauden datuek ondorioztatzera eramaten gaituzte nsp9-ren NMPilatutako formak proteina-induzitutako RNA sintesian duen eginkizun espezifikoa koronavirusentzako eta beste birus habiaratuentzako arrazoizko eszenatokia dela, eta NiRAN identifikatu gabeko beste proteina batzuk ere jo ditzakeela.Birusa erregulatu.Ostalariaren interakzioa.Baieztatzen bada, ARN birikoaren sintesian proteina-habeek parte hartzeak Mpro/3CLpro eta RdRp domeinuen sekuentzia-afintasuna areagotuko du aurretik detektaturiko koronavirusaren eta pikornabirus-itxurako supertaldearen (9) artean, orain gutxi ezarri diren Pisoniviriteetan (9) bateratu direnak ( 46) kategorian.
Gure datuek ere erakusten dute ikerketa honetan identifikatutako entzima-jarduera oinarrizko, selektibo eta kontserbadoreak birusen aurkako sendagaien helburu gisa erabil daitezkeela.NiRAN-en gune aktiboan kontserbatutako nsp9 N-muturraren lotura (eta ondorengo aldaketa) oztopatzen duten konposatuak birusen aurkako sendagai eraginkor eta aldakor bihur daitezke, infekzio (azpi)genero desberdinetako animalia eta giza koronavirusak tratatzeko egokiak. , SARS-CoV-2 eta Ekialde Hurbileko arnas sindromearen koronabirusa barne.
Ikerketa honetan sortutako koronavirus-proteinaren kodetze-sekuentzia RT-PCR bidez anplifikatu zen HCoV-229E-rekin infektatutako Huh-7 edo SARS-CoV-2-rekin infektatutako Vero E6-tik isolatutako RNA erabiliz, eta klonazio-prozedura estandarrak erabiliz txertatu zen.pMAL-c2 (New England Biological Laboratory) edo pASK3-Ub-CHis6 (47) adierazpen-bektorea (SI eranskina, S1 eta S2 taulak).Kodoi bakarreko ordezkapenak PCRn oinarritutako gune-zuzendutako mutagenesiaren bidez sartu ziren (48).MBP fusio-proteina ekoizteko, E. coli TB1 zelulak pMAL-c2 plasmidoaren eraikuntza egokiarekin eraldatu ziren (SI eranskina, S1 taula).Fusio-proteina amilosa afinitate-kromatografia bidez purifikatu eta Xa faktorearekin moztu zen.Ondoren, C-terminaleko His6 etiketatutako proteina Ni-mobilizatutako metalen afinitate kromatografiaren bidez (Ni-IMAC) aurretik deskribatu bezala (49).Ubikitina fusio-proteina ekoizteko, E. coli TB1 zelulek pASK3-Ub-CHis6 plasmidoaren eraikuntza egokia (SI eranskina, S1 eta S2 taulak) eta ubikitinaren C-terminal hidrolasa 1 (Ubp1) kodetzen duen pCGI plasmidoaren DNA erabili zuten.Eraldaketa (47).C-terminaleko His6 etiketadun koronavirus proteina aurretik deskribatu bezala araztu zen (50).
HCoV-229E nsp12-His6-ren auto-NMPylation proba EAV nsp9-n (16) deskribatzen den moduan egin zen.Laburbilduz, nsp12-His6 (0,5 µM) 50 mM 4-(2-hidroxietil)-1-piperazineetanosulfoniko azido (HEPES)-KOH dauka, pH 8,0, 5 mM ditiotreitol (DTT), 6 mM MnCl2, 25 µM tampon inkubatu. zehaztutako NTP eta 0,17 µM-ek [α32-P]NTP (3.000 Ci/mmol; Hartmann Analytic) parekatu zuten 30 °C-tan 30 minutuz.Nsp12-ren bidez nsp9 NMPylation-aren beste NMPilazio-saio guztietan (estandarrak), erreakzio-baldintzak honela doitzen dira: nsp12-His6 (0,05 µM) eta nsp9-His6 (4 µM) 50 mM HEPES-KOH (pH 80) aurrean. ), 5 mM DTT, 1 mM MnCl2, 25 µM adierazitako NTP eta 0,17 µM bat [α32-P]NTP.10 minutuz 30 °C-tan inkubatu ondoren, erreakzio lagina SDS-PAGE lagin tamponarekin nahastu zen: 62,5 mM tris(hidroximetil)aminometano HCl (pH 6,8), 100 mM DTT, %2,5 SDS, %10 glizerola eta %0,005 bromofenol. urdina.Proteina desnaturalizatu zen 90 °C-tan 5 minutuz berotuz eta %12 SDS-PAGEz bereizi zen.Gela Coomassie Brilliant Blue disoluzioarekin finkatu eta tindatzen da (% 40 metanola, % 10 azido azetikoa, % 0,05 Coomassie Brilliant Blue R-250), koloreztatu eta 20 orduz irudi fosforeszente baten aurrean jartzen da (NMPylation-tik nsp12 detektatzeko) edo (gehienez) 2 ordu (nsp9 NMPylation ebaluatzeko).Pantaila eskaneatzeko Typhoon 9200 imager (GE Healthcare) erabili zen eta ImageJ seinalearen intentsitatea aztertzeko.
MS analisirako, 1 µM nsp12-His6 eta 10 µM nsp9 (hexahistidina etiketarik gabe) erabili ziren NMPylation analisian (SI eranskina, S1 taula) eta 500 µM UTP eta GTP-ko kontzentrazioa handitu zen.Haien kontzentrazio eta espero den proteina-kalitatearen arabera, MassPrep zutabe batekin (Waters) hornitutako Waters ACQUITY H-Class HPLC sistema erabili zen 1 eta 10 µL tamponed proteina-soluzio linean dessaltzeko.Proteina gatzgabetua Synapt G2Si masa-espektrometroaren elektrospray ioi-iturrira elutzen da (Urak) A tamponaren (ura/% 0,05 azido formikoa) eta B tamponaren (azetonitrilo/% 0,045 azido formikoaren) gradientearen bidez, eta zutabearen tenperatura da. 60 °C eta 0,1 ml/min-ko emaria: isokratikoki elutzea %5 A-rekin 2 minutuz, gero gradiente lineala %95 B-ra 8 minututan, eta mantendu %95 B beste 4 minutuz.
500 eta 5000 m/z arteko masa-tartea duten ioi positiboak detektatzen dira.Glu-fibrinopeptidoa B 45 segundoro neurtzen da masaren noraez automatikoki zuzentzeko.Erabili MassLynx tresnaren softwarea MaxEnt1 luzapenarekin batez besteko espektroa deskonvolvitzeko oinarri-lerroa kendu eta leuntzeko.
UMPylated HCoV-229E nsp9 digeritu zen sekuentziazio maila aldatutako tripsina (Serva) gehituz eta gau osoan inkubatu zen 37 °C-tan.Chromabond C18WP spin zutabe bat (730522 pieza zenbakia; Macherey-Nagel) erabili zen peptidoak gatzgabetzeko eta kontzentratzeko.Azkenik, peptidoa 25 µL uretan disolbatu zen, %5 azetonitriloa eta %0,1 azido formikoa zituena.
Laginak MS-k aztertu ditu Orbitrap Velos Pro masa-espektrometroa erabiliz (Thermo Scientific).Azken nanoâ HPLC sistema (Dionex), 50 cm-ko amaiera pertsonalizatu batekin hornitua.75 μm C18 RP zutabea 2,4 μm ale magnetikoz josia (Albin Maisch High Performance LC GmbH doktorea) Konektatu lineako masa espektrometrora Proxeon nanospray iturriaren bidez;injektatu 6 µL tripsina digestio-soluzio 300 µm-ko barne-diametro batean ×??1 cm C18 PepMap aurrekontzentrazio-zutabea (Thermo Scientific).Ura/% 0,05 azido formikoa disolbatzaile gisa erabiliz, lagina automatikoki harrapatu eta gatzgabetu zen 6 µL/min-ko emariarekin.
Ura/% 0,05 azido formiko (A disolbatzailea) eta % 80 azetonitrilo/% 0,045 azido formiko (B disolbatzailea) gradiente hauek erabili dira peptido triptikoen bereizketa 300 nL/min-ko emariarekin lortzeko: % 4 B-rako. 5 minutu, gero 30 A gradiente lineal B% 45era minutu barru, eta igoera lineala % 95 B disolbatzailera 5 minututan.Konektatu zutabe kromatografikoa altzairu herdoilgaitzezko nano-igorle batera (Proxeon), eta elutzailea zuzenean ihinztatu masa-espektrometroaren kapilar berotuarekin 2.300 V-ko potentziala erabiliz. Orbitrap masa- analizatzailean 60.000ko bereizmena duen inkesta eskaneatzea lotuta dago. Gutxienez hiru datu MS/MS miaketarekin, 30 segundoz dinamikoki baztertuta, ioi-tranpa linealaren talka eragindako disoziazioa edo energia handiagoko talkaren disoziazioa erabiliz, orbitalaren detekzioarekin konbinatuta, bereizmena 7.500 da.
Argitalpenaren ordua: 2021-03-03